基因，就像是指揮官手里拿著的建筑總圖紙，調(diào)控著生物體的一切生命活動(dòng)。這份施工的圖紙決定了整個(gè)建筑的所有呈現(xiàn)形式。那怎么才能對“圖紙”——基因進(jìn)行編輯呢？CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)被認(rèn)為是最佳的一種工具。
1月6日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院戴磊課題組在ACS Synthetic Biology上發(fā)表最新成果，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了針對人體腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，可以對人體腸道擬桿菌的“圖紙”進(jìn)行修改，具有可進(jìn)行流程化操作和無篩選標(biāo)記、編輯效率高等特點(diǎn)。團(tuán)隊(duì)成員鄭靈剛和譚揚(yáng)為共同第一作者，戴磊為最后共同通訊作者。
“該方法突破了傳統(tǒng)方法在編輯效率、基因簇刪除和多基因編輯方面的瓶頸，為進(jìn)一步理解腸道微生物組的功能以及活菌藥物的開發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)?！贝骼诒硎?。
讓CRISPR/Cas“操刀” 打開腸道微生物組“窗口”
腸道擬桿菌屬作為腸道中數(shù)量最高的細(xì)菌之一，被視為研究腸道微生物組的“窗口”，研究腸道擬桿菌可以為研究其他腸道微生物提供基礎(chǔ)。此外，擬桿菌屬細(xì)菌也與肥胖、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌等多種疾病相關(guān)。目前對于人體腸道菌擬桿菌屬已有的基因遺傳操作工具存在諸如流程復(fù)雜、編輯效率低等缺點(diǎn)，限制了進(jìn)一步對腸道菌群和人體健康的研究。
如果可以進(jìn)一步開發(fā)腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，將為研究其他腸道微生物打通“道路”，也為治療人類多種疾病提供更多可能性。為了獲得簡便、高效的遺傳操作工具，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于CRISPR/Cas的編輯系統(tǒng)，可以根據(jù)研究者的需要，構(gòu)建無篩選標(biāo)記的擬桿菌突變株。
那么“操刀”師傅CRISPR/Cas是如何流程化操作的呢？
首先，研究人員使用穿梭質(zhì)粒作為“馬車” ，讓其攜帶“涂改”工具（剪刀和修復(fù)畫筆，即Cas基因和修復(fù)模板）進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。在接收到需要涂改的命令（加入誘導(dǎo)劑）后，Cas基因?qū)⒈磉_(dá)出來的Cas蛋白作為“剪刀”，剪開gRNA靶向的基因位置，完成對目標(biāo)片段的刪除。其次，在有修復(fù)模板（修復(fù)畫筆）存在時(shí)，隨即可將修復(fù)模板通過同源重組的方式插入到目標(biāo)位置，完成基因的插入。最后，通過在培養(yǎng)基中傳代，從而實(shí)現(xiàn)獲得無篩選標(biāo)記的擬桿菌突變株。利用此方法，可流程化地獲得腸道工程菌，為未來活菌藥物的設(shè)計(jì)與構(gòu)建提供新的工具。
CRISPR/Cas編輯示意圖 來源：科研團(tuán)隊(duì)供圖
高效、多功能的基因組編輯工具
擬桿菌屬的傳統(tǒng)編輯工具的效率為4%-25%之間，該研究團(tuán)隊(duì)通過利用CRISPR/Cas系統(tǒng)，使其編輯效率可以達(dá)到80%-100%。這將極大地促進(jìn)對腸道菌群和人體健康的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。
“馬車”、“剪刀”等工具在此過程中都起著舉足輕重的作用，該團(tuán)隊(duì)在擬桿菌屬中測試了不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)FnCas12a蛋白（剪刀），可以實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯。基于此，團(tuán)隊(duì)測試該系統(tǒng)在多形擬桿菌中可以實(shí)現(xiàn)大片段的刪除和外源基因的高效插入。
“外源基因GFP是一個(gè)熒光蛋白，若能成功插入到基因組中，即可觀察到菌體發(fā)出綠色熒光，供我們查看‘涂改’成功與否?！贝骼诒硎?。
基因簇的刪除和外源基因的插入來源：科研團(tuán)隊(duì)供圖
此外，該系統(tǒng)也成功在卵形擬桿菌、脆弱擬桿菌、普通擬桿菌、單形擬桿菌等多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)高效率的基因編輯。
高效、精準(zhǔn)的基因組編輯方法對于解析腸道微生物組的功能、開發(fā)工程腸道益生菌都是不可或缺的工具。與之前針對擬桿菌屬基因基因遺傳操作工具相比，該團(tuán)隊(duì)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的工具極大的提高了基因編輯的效率，同時(shí)也更容易實(shí)現(xiàn)無篩選標(biāo)記突變株的獲得。戴磊表示，未來，該技術(shù)將推動(dòng)腸道菌群與人體健康的機(jī)制研究，有望實(shí)現(xiàn)重大慢性疾病的預(yù)防和治療。
