他們還分析探討了多種藥物發(fā)現(xiàn)策略，該研究為迅速開(kāi)發(fā)具有臨床潛力的抗新冠肺炎的藥物奠定了重要基礎(chǔ)。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)確定了新冠病毒主蛋白酶的強(qiáng)效抑制劑N3。此外，團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行了10000多種化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)了雙硫侖（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等多種對(duì)主蛋白酶有顯著抑制作用的藥物。
據(jù)中科院藥物所介紹，上述“抗新冠病毒攻關(guān)聯(lián)盟”由上?？萍即髮W(xué)-清華大學(xué)饒子和/楊海濤團(tuán)隊(duì)、中科院上海藥物所蔣華良團(tuán)隊(duì)、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院秦成峰團(tuán)隊(duì)以及中科院武漢病毒所石正麗團(tuán)隊(duì)、肖庚富團(tuán)隊(duì)等組成。國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）主任兼上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授許文青、澳大利亞昆士蘭大學(xué)的Luke W. Guddat教授也參與了此項(xiàng)研究。
該項(xiàng)研究的通訊作者為上海藥物所研究員兼上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所特聘教授蔣華良院士、清華大學(xué)教授兼上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所特聘教授饒子和院士、上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所課題組長(zhǎng)楊海濤研究員（兼生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副教授）。
新冠疫情在中國(guó)尚處于爬坡期的1月25日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所曾宣布：由蔣華良院士和饒子和院士領(lǐng)銜、20余個(gè)課題組參與的中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所和上海科技大學(xué)免疫化學(xué)研究所抗新冠病毒感染聯(lián)合應(yīng)急攻關(guān)團(tuán)隊(duì)篩選出了30種具備治療潛力的藥物。隨后的1月26日，饒子和/楊海濤課題組測(cè)定的新冠病毒主蛋白酶（Mpro）的高分率晶體結(jié)構(gòu)對(duì)外公布，以便有更多的科技工作者、特別是從事藥物研發(fā)的科技人員使用。
新冠病毒是一種單鏈RNA正鏈包膜乙型冠狀病毒，入侵細(xì)胞后，新冠病毒會(huì)立即利用細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成自身復(fù)制必需的兩條超長(zhǎng)復(fù)制酶多肽（pp1a和pp1ab）。這兩條復(fù)制酶多肽需要被剪切成多個(gè)零件（如RNA依賴的RNA聚合酶、解旋酶等等）；這些零件進(jìn)一步組裝成一臺(tái)龐大的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)器，然后病毒才能啟動(dòng)自身遺傳物質(zhì)的大量復(fù)制。
兩條復(fù)制酶多肽的剪切要求異常精確，因此病毒自身編碼了一把神奇的“魔剪”——主蛋白酶Mpro。Mpro在復(fù)制酶多肽上存在至少11個(gè)切割位點(diǎn)，只有當(dāng)這些位點(diǎn)被正常切割后，這些病毒復(fù)制相關(guān)的“零件”才能順利組裝成復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)器，啟動(dòng)病毒的復(fù)制。
正是由于主蛋白酶在病毒復(fù)制過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，且人體中并無(wú)類似的蛋白質(zhì)，因此主蛋白酶就成為一個(gè)抗新冠病毒的關(guān)鍵藥靶，抑制這種酶的活性將有效阻止病毒復(fù)制。
值得一提的是，除了主蛋白酶Mpro，此次疫情期間，饒子和團(tuán)隊(duì)還領(lǐng)銜成功解析了新型冠狀病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）的結(jié)構(gòu)，率先探討了廣受關(guān)注的抗病毒藥物瑞德西韋（GS-5734）治療新冠肺炎的病毒靶標(biāo)。其團(tuán)隊(duì)在SARS（嚴(yán)重急性呼吸綜合征）疫情暴發(fā)期間，就曾在世界上解析了首個(gè)SARS病毒蛋白質(zhì)（主要蛋白酶）的三維空間結(jié)構(gòu)。
全球首次解析新冠病毒“主蛋白酶-N3”三維空間結(jié)構(gòu)
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定了COVID-19病毒Mpro的分子量為33797.0 Da，與其理論分子量33796.8 Da相符。
在此前的研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了邁克爾受體抑制劑N3，該抗體可以特異性抑制多種冠狀病毒主要蛋白酶，其中包括SARS-CoV（嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒）和MERS-CoV（中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒）的Mpro。
研究人員接下來(lái)構(gòu)建了新冠病毒Mpro的同源性模型，并使用分子對(duì)接來(lái)確定N3是否可以靶向這種新的冠狀病毒的Mpro。
研究人員發(fā)現(xiàn)，一個(gè)對(duì)接形態(tài)表明N3可以進(jìn)入底物結(jié)合口袋（the substrate-binding pocket），而這一“口袋”恰恰因?yàn)楦叨缺Ｊ匦远梢宰鳛樵O(shè)計(jì)廣譜抑制劑的藥物靶標(biāo)。
（左）新冠病毒主蛋白酶-抑制劑N3的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；（右）冠狀病毒主蛋白酶的底物結(jié)合口袋是一個(gè)保守藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)
隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用晶體衍射技術(shù)，獲得了分辨率為2.1埃的N3與Mpro復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在新冠病毒主要蛋白酶結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域II形成六鏈反平行β-桶形結(jié)構(gòu)，在它們之間的裂縫中帶有底物結(jié)合位點(diǎn)，即藥物靶標(biāo)“口袋”。
值得注意的是，早在1月26日，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)定的Mpro高分率晶體結(jié)構(gòu)已在PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank, PDB）上公開(kāi)。自1月26日起，團(tuán)隊(duì)已為國(guó)內(nèi)外300多家高校、研究機(jī)構(gòu)及企業(yè)的實(shí)驗(yàn)室直接提供了數(shù)據(jù)。該結(jié)構(gòu)也被PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)選為2020年2月的明星分子（February Molecule of the Month）。
事實(shí)上，隨著新冠疫情在全球暴發(fā)，科學(xué)家們一直在努力尋找有效的病毒抑制劑。此前3月20日，《科學(xué)》（Science）雜志發(fā)表了德國(guó)呂貝克大學(xué)生物化學(xué)研究所Rolf Hilgenfeld等人的研究，他們通過(guò)對(duì)新冠病毒主要蛋白酶結(jié)構(gòu)的解析，對(duì)此前的抑制劑進(jìn)行了優(yōu)化，并認(rèn)為一種名為13b的α-酮酰胺抑制劑顯示出明顯的肺向性，并且適用于通過(guò)吸入途徑給藥。
多種策略篩選潛在藥物：依布硒和N3均能在細(xì)胞水平顯著抑制新冠病毒復(fù)制
目前，對(duì)于新冠病毒的治療還沒(méi)有特效藥物。為了快速發(fā)現(xiàn)具有臨床潛力的抗病毒化合物，研究團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合從頭設(shè)計(jì)、虛擬藥物篩選和高通量篩選的策略，以確定現(xiàn)有藥物是否能靶向COVID-19病毒的Mpro。
與N3結(jié)合的新冠病毒Mpro復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)于通過(guò)計(jì)算機(jī)篩選來(lái)鑒定潛在靶向藥物提供了一種模型，研究人員進(jìn)而建立了潛在結(jié)合化合物的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)。
結(jié)果表明，肉桂硫胺（cinanserin）能夠與底物結(jié)合口袋緊密結(jié)合，對(duì)Mpro的IC50（半抑制濃度）值為125μM。
肉桂硫胺是一種血清胺拮抗制劑，在1960年代已在人體中進(jìn)行了初步臨床測(cè)試，并且先前已顯示出抑制SARS-CoV的Mpro的作用。肉桂硫胺在上世紀(jì)70年代用于治療精神分裂癥，對(duì)冠狀病毒3CL水解酶具有抑制作用。
團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，它具有作為抗新冠病毒藥物的優(yōu)化潛力。為了表征其酶促活性并進(jìn)行抑制劑的高通量篩選，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析方法。
接下來(lái)，攻關(guān)“聯(lián)盟”繼續(xù)聯(lián)合利用虛擬篩選和高通量篩選策略相結(jié)合的方式，對(duì)10000多個(gè)老藥、臨床藥物以及天然活性產(chǎn)物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種對(duì)主蛋白酶有顯著抑制作用的先導(dǎo)藥物，其中包括雙硫侖（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等。
其中，依布硒對(duì)于新冠病毒Mpro的抑制作用最強(qiáng)。值得一提的是，依布硒已用于治療聽(tīng)力障礙等多種疾病的臨床試驗(yàn)（完成臨床二期），并具有很好的安全性表現(xiàn)。
為了進(jìn)一步證實(shí)它們體外的酶促抑制結(jié)果，研究人員進(jìn)行了后續(xù)的抗新冠病毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，依布硒和N3均能在細(xì)胞水平顯著抑制新冠病毒的復(fù)制。
攻關(guān)團(tuán)隊(duì)表示，“在這一研究中，基于結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)、計(jì)算機(jī)虛擬篩選和高通量篩選三種研究策略的結(jié)合被證明是找到針對(duì)抗新冠病毒藥物的有效策略?！?/p>
研究者們認(rèn)為，這種篩選策略有效性較高，可以快速發(fā)現(xiàn)具有臨床潛力的藥物，以應(yīng)對(duì)尚無(wú)特定藥物或疫苗的新傳染病。
